新型犬细小病毒2型的出现及其在貉中的发病机制

摘要

从患有严重肠炎的浣熊犬中分离出三种细小病毒，分别命名为RDPV-DP1、RDPVDP2和RDPV-DP3。3个分离株的VP2基因在核苷酸水平上的同源性为99.9%，与参考CPV的同源性为99.1%-99.5%。RDPV与原始CPV-2相似，但有四个突变。RDPV显示VP2蛋白的SA为CPV-2a或CPV-2b，在世界大部分地区流行。在3个分离株中发现了ND残基，类似于CPV-2a/2b/2c。3株分离株均存在VP2残基VL的自然突变，该突变与残基和相邻，可能与宿主范围有关。有趣的是，VP2S27T首次在分离株中发现。VP2基因的系统发育分析显示，RDPVs聚集在一个小的进化分支中，与7个浣熊犬的CPV-2分离物和1个狐狸的CPV-2分离物共享同一分支，而不是与CPV疫苗病毒。NS1基因的系统发育分析表明，RDPV与参考CPV-2a/2b/2c具有相同的分支。实验感染表明，RDPV感染引起浣熊犬的高发病率。这意味着RDPV对浣熊犬有毒力，并在中国继续进化。

结果与讨论

从腹泻浣犬中分离出3种细小病毒，分别命名为rdpv-dp1、rdpv-dp2和rdpv-dp3。

1.rdpvs的分子特征

3株RDPV的VP2基因在核苷酸水平上表现出99.9%的同源性，与参考CPV的同源性为99.1%-99.5%。各分离株VP2蛋白的推导氨基酸序列具有%的相似性，与参考CPV的相似性为98.6%-99.5%。3个RDPV保留了原CPV-2的VP2蛋白80R、93N、A、N、S和G，应鉴定为CPV-2。但VP2蛋白有四个突变（表1）。大约在年和年，来自浣熊犬的7种参考CPV和来自狐狸的1种参考CPV在中国也是CPV-2（表1）。芬兰浣熊犬的RD-80（U）和RD-87（U）为CPV-2。但3个RDPV显示VP2SA为CPV-2a或CPV-2b，20世纪90年代初在世界大部分地区流行。带有VP2A的CPV-2a和CPV-2b在中国流通。残留物位于VP2位置附近。CPV可能在TfR结合期间利用粘附增强机制，VP2位置处病毒衣壳的单一突变可深刻改变受体结合和感染性。

表1分离株和参考病毒的vp2蛋白的氨基酸序列变化

在3个分离物、7个来自浣熊犬的参考CPV和一个来自中国狐狸的参考CPV中发现了ND残基，类似于CPV-2a/2b/2c。仅在一些最初的CPV-2分离株中发现了N残基，在后来的CPV变体中恢复为D残基，该残基位于三倍峰的一侧，与残基一起确定HA的pH依赖性。

3株分离株、7株犬cpv参考毒株、1株狐狸cpv参考毒株和3株中国犬cpv参考毒株均存在vp2vl自然突变（表1）。在FPV中观察到的阳性选择较少，只有VP2残基似乎处于阳性选择下。两个紧密空间接近的残基和部分决定了FPV的体内宿主范围。VP2VL的替代可能与宿主有关。有趣的是，在3个RDPV中发现了VP2S27T，它与VP2蛋白N端（氨基酸11至23）的单克隆抗体3C9识别的表位很接近（Cortes等人，年）。但VP2S27T的意义有待进一步研究。三个分离株的NS1基因在核苷酸水平上共享99.3%–99.8%，与参考CPV的同源性为98.9%–%。三个分离株的NS1蛋白具有99.6%-99.9%的相似性，与参考CPV的相似性为99.0%-%。

VP2基因的系统发育分析显示，RDPV和参考菌株聚集成四个分支（图1）。RDPV聚集成一个小的进化分支，与浣熊犬的7个CPV-2和狐狸的1个CPV-2共享同一分支，而不是与CPV疫苗病毒共享。NS1基因的系统发育分析显示，RDPV与参考菌株形成三个进化分支，并与参考CPV-2a/2b/2c共享同一分支（图2）。

图1vp2基因序列的系统发育树

图2ns1基因序列的系统发育树

2.浣熊犬rdpv-dp1的发病机制

在第4天至第9天，受挑战的浣熊犬出现临床症状，包括食欲减退、迟钝、嗜睡和腹泻。出现腹泻后，粪便中含有大量粘液。粪便主要是水状液体，甚至是血性液体。食欲不振的平均时间是从第5天开始，出现水样腹泻甚至血性液体的平均时间是从第7天开始。接种动物的发病率为%。从第1天到第12天，通过PCR确认接种动物的病毒脱落。在第5天到第7天，激发组的直肠拭子洗脱物的峰值滴度为.1-.2TCID50/ml。在第5天和第7天被安乐死的激发浣熊狗中发现组织学损伤，包括脾脏淋巴细胞减少、肠系膜淋巴结淋巴细胞减少和网织细胞增多，肠固有层的肠绒毛断裂和炎性细胞浸润（图3）。第5天采集的脾脏、肠系膜淋巴结和消化道组织经PCR检测呈阳性，只有第7天采集的消化道组织呈阳性，其他组织样本呈阴性。来自组织的VP2基因片段被鉴定为与接种的病毒相同。第5天和第7天采集的消化道组织滴度为.1–.3TCID50/g，其他组织的CPV重新分离为阴性。PCR和病毒分离之间的差异可能是由于采样时间不同。除被安乐死的浣熊狗外，所有其他受挑战的浣熊狗均已康复。存活的动物脱水、虚弱，但恢复进食，临床完全恢复。在攻毒第7天从动物身上采集的血清样本的HI滴度为1:32–1:，在p.i.第15天为1:–1:。对照动物没有临床症状、病毒脱落和血清转化。这意味着RDPV对浣熊狗有毒力。

图3实验动物组织的组织病理学表现

RDPV在中国浣熊犬中传播了至少8年，并在继续进化，不是CPV-2疫苗病毒。替代宿主和中间宿主通常被提议为广泛分离的宿主物种之间的病毒转移提供桥梁。因此，有必要进行进一步积极和仔细的流行病学调查，以了解该地区和世界范围内的CPV演变动态。

编辑：许丽文